就在紅軍部隊(duì)為躲避國(guó)民黨步步緊逼的進(jìn)攻而開始長(zhǎng)征的同時(shí)，日本軍隊(duì)也進(jìn)一步加強(qiáng)了對(duì)東北的控制。截至1935年，日本人開始向華北地區(qū)進(jìn)軍。面對(duì)日本侵華力度的加大，國(guó)民黨黨內(nèi)的一些將軍試圖勸說(shuō)蔣介石抗日。然而，蔣介石固執(zhí)己見，認(rèn)為打擊共產(chǎn)黨比保衛(wèi)國(guó)家不受日本侵略更為重要。這一分歧最后導(dǎo)致了1936年12月著名的“西安事變”，張學(xué)良將軍發(fā)動(dòng)了反對(duì)蔣介石的行動(dòng)。張學(xué)良原本也是東北軍閥，后來(lái)他在東北的地位被日本人取代，國(guó)民黨政府安排他到新的作戰(zhàn)基地西安負(fù)責(zé)圍剿共產(chǎn)黨。張學(xué)良對(duì)他所得到的新的任命非常不悅，他堅(jiān)信日本才是當(dāng)時(shí)中國(guó)最大的威脅。于是他策劃、組織了對(duì)蔣介石的綁架，將蔣介石作為人質(zhì)扣押了兩個(gè)星期，直到蔣答應(yīng)與共產(chǎn)黨協(xié)商合作。共同抗日才將其釋放。

與此同時(shí)，除了集中精力處理黨內(nèi)事務(wù)，和在長(zhǎng)征中奮力求得生存并在延安開展黨建工作外，毛澤東也一直密切注視著日本人的動(dòng)向。他抓住一切機(jī)會(huì)寫作并發(fā)表分析評(píng)論文章，譴責(zé)蔣介石背信棄義的行為。1935年到1936年間，毛澤東發(fā)表了一系列連續(xù)將“日本帝國(guó)主義”和“蔣介石的背叛”聯(lián)系起來(lái)的文章和演講。毛澤東認(rèn)為，蔣介石是日本帝國(guó)主義“侵掠”中國(guó)的“清道夫”，“在中國(guó)的反動(dòng)支柱”。通過(guò)將日本如此輕易叩開中國(guó)大門的責(zé)任推到蔣介石身上，毛澤東得以將他自己和他領(lǐng)導(dǎo)下的中國(guó)共產(chǎn)黨置于抵抗日本的最前線。在發(fā)給張學(xué)良將軍的電報(bào)中，毛澤東宣稱，張學(xué)良扣押蔣介石不僅僅將國(guó)民黨逼上了抗日的道路，而且還“驅(qū)逐了軍隊(duì)中的法西斯分子，向廣大官兵昭示了蔣介石出賣國(guó)家、傷害人民的罪行” 。

毛澤東清晰地表達(dá)了希望蔣介石永遠(yuǎn)讓出職權(quán)的愿望。但事態(tài)并未如此發(fā)展。與此相反，共產(chǎn)黨不得不與蔣介石協(xié)商，以開展新一輪的兩黨合作。協(xié)商耗時(shí)八個(gè)月，最終實(shí)現(xiàn)了國(guó)共兩黨間的第二次合作。與第一次國(guó)共合作不同，這一次的合作保證了兩黨各自的獨(dú)立性。周恩來(lái)作為組長(zhǎng)帶領(lǐng)共產(chǎn)黨談判小組赴國(guó)民黨首都南京。毛澤東在寫給周恩來(lái)的信中說(shuō)道：“首要原則就是保證我們”對(duì)紅軍部隊(duì)的“絕對(duì)領(lǐng)導(dǎo)權(quán)”；“原則是保證我黨的獨(dú)立性。在這些方面，我們絕不能妥協(xié)讓步。”

1937年7月，日本軍隊(duì)以北平盧溝橋事變?yōu)榻杩?，發(fā)起全面侵華戰(zhàn)爭(zhēng)。由于國(guó)民黨軍隊(duì)的混亂無(wú)序，日本軍隊(duì)以風(fēng)馳電掣般的速度從北平向中國(guó)南部地區(qū)行進(jìn)。1937年11月，另一股日軍攻占上海，那里的國(guó)民黨軍隊(duì)雖然進(jìn)行了英勇的抵抗，但這種防衛(wèi)最終還是徒勞無(wú)功。日本軍隊(duì)長(zhǎng)驅(qū)直入，直攻國(guó)民黨政府首都南京，在那里他們犯下了滔天罪行，發(fā)起了侵華戰(zhàn)爭(zhēng)期間最臭名昭著的“南京大屠殺”。蔣介石命令國(guó)民黨部隊(duì)撤離南京，逃到內(nèi)陸地區(qū)。于是，日本軍隊(duì)就進(jìn)入了一座沒(méi)有任何防守的城市。他們四處殺人放火，奸淫擄掠，暴力放蕩的日本人將殺人當(dāng)成消遣，殘忍殺害數(shù)十萬(wàn)手無(wú)寸鐵的中國(guó)人。這種慘無(wú)人道的行徑，在隨后日本占領(lǐng)中國(guó)長(zhǎng)達(dá)八年的時(shí)間里，樹立了殘忍折磨中國(guó)人的行為模式。到20世紀(jì)30年代末，這種行為模式被簡(jiǎn)化為日本軍隊(duì)的官方教條“三光”政策：燒光、搶光、殺光。

鑒于形勢(shì)的惡化，第二次統(tǒng)一戰(zhàn)線的部署非常急促。毛澤東停止了對(duì)蔣介石的書面攻擊，蔣介石也結(jié)束了國(guó)民黨部隊(duì)對(duì)延安的封鎖。國(guó)共兩黨間的合作在1937年秋終于達(dá)成。這次國(guó)共合作維系了幾年的時(shí)間，其間幾經(jīng)波折和反復(fù)磨合。毛澤東一直保持著對(duì)統(tǒng)一戰(zhàn)線名義上的忠誠(chéng)，即便是在20世紀(jì)40年代早期統(tǒng)一戰(zhàn)線破裂之時(shí)。