主張政教分離，是新教的一個(gè)特色，新教在本質(zhì)上都是主張政教分離的，因?yàn)檫@是它基本教義所導(dǎo)致的必然結(jié)論。路德闡述了政教分離的教理和《圣經(jīng)》依據(jù)之后，眾多的新教教派在“因信成義”的教義基礎(chǔ)之上以及對(duì)天主教的政教合一的傳統(tǒng)的反省基礎(chǔ)之上，主張政教分離。

路德之后在德國(guó)興起的敬虔主義（Pietism）運(yùn)動(dòng)，是對(duì)以后的新教造成很大影響的宗教運(yùn)動(dòng)，現(xiàn)在北美的大多數(shù)新教教派都很大程度地受了敬虔主義的影響。比如在北美具有眾多教友的圣公會(huì)、長(zhǎng)老會(huì)、浸道會(huì)、衛(wèi)理宗等等，都吸收了敬虔主義的教義，一些大的教會(huì)支派直接就是敬虔主義的分支，如圣潔會(huì)、五旬節(jié)派、靈恩派、拿撒勒派、靈召會(huì)等等。敬虔主義的一個(gè)很大的特色就是主張徹底的政教分離，該教派的創(chuàng)始人之一施本爾（Philinn Jacob Spener）把政教合一稱為凱撒教宗主義，認(rèn)為是天主教的惡劣傳統(tǒng)。另一位創(chuàng)始人親岑多夫（Count Von Zinzendorf）主張，國(guó)家不能強(qiáng)制宗教信念或習(xí)俗，良心具有完全的自由，政府與教會(huì)應(yīng)該完全獨(dú)立。

新教的再洗禮派是激進(jìn)的政教分離和信教自由的主張者。再洗禮派現(xiàn)在在北美也很有影響，它的一些主張現(xiàn)在在新教界都成了理所當(dāng)然的見解，如成人洗禮、反對(duì)教會(huì)內(nèi)迫害異端的做法等等，門諾派教會(huì)是他的直接延續(xù)。再洗禮派把政教合一稱為君士坦丁主義，認(rèn)為任何教會(huì)與政府的官方關(guān)系都是不合法的，因?yàn)橐d和使徒從頭到尾都沒有認(rèn)可這種關(guān)系。

此外，靈修派以及現(xiàn)在仍有較大影響的一神論派等，都對(duì)政教分離的原則做過闡述。