1918年西班牙流感，最致命的流行病

1918病毒

“西班牙流感”1918年出現，1920年消失。對一百年前這場席卷全世界的流感，我們普通人了解甚少，或者說根本不關心，如果不是一場新的疫情出現在我們身邊。過去我對它的了解僅止于早年閱讀茨威格的故事《一個陌生女人的來信》，“陌生女人”臨死前描述了自己和兒子的病情：頭痛、四肢酸痛和持續(xù)高燒；還提到“現在流感挨家挨戶地蔓延”。另外還從《顧維鈞回憶錄》中讀到他的妻子唐寶玥——當時國務總理唐紹儀的女兒也死于這場流感。

《一個陌生女人的來信》

顧維鈞和唐寶玥

據美國疾控中心（CDC）網站，1918年在全世界范圍內大爆發(fā)的這場流感有五億人染病，占當時世界人口十八億的近三分之一，至少五千萬人死亡，死亡率高達百分之十，僅美國死亡人數就有六十七萬五千。此前或此后發(fā)生的任何流行病都沒有這么高的死亡率，因此西班牙流感被稱為“人類有史以來最致命的疫情”。西班牙流感的特征是傳染力極強。首個病例出現在美國，1918年3月，堪薩斯州某軍營里有一百名士兵發(fā)病，一周之內病例就增加了五倍。另外一個特征是十五至三十四歲之間的青壯年死亡率高，這場疫情使得美國整體壽命降低了十二年?？茖W家認為一戰(zhàn)末期各國士兵的調動和返鄉(xiāng)，是將這場疫情傳播到世界各地的主要因素之一。從我們普通人的角度來看，持續(xù)四年的殘酷戰(zhàn)爭破壞了生態(tài)平衡，導致饑荒，使人們普遍健康水平下降，免疫力低下，可能也都是使病毒有機會進攻并失控的原因。當時醫(yī)療條件和設備缺乏，抗生素尚未發(fā)明（1928年首次發(fā)明青霉素），醫(yī)生沒有有效的手段來對付一種危害嚴重的病毒導致的炎癥，也是死亡率極高的原因。

西班牙流感病毒肆虐之后就銷聲匿跡再也沒有出現，科學家希望通過重組病毒來解釋當年的病毒起源，并且為將來可能發(fā)生的疫情做好防備。美國CDC網站上辟有專門欄目詳細介紹這場疫情的始末以及一百年來科學家為追根尋源做出的努力，其中有一文非常值得推薦：《最為致命的流感：1918流行病毒的發(fā)現和重組全敘述》（The Deadliest Flu: the Complete Story of the Discovery and Reconstruction of the 1918 Pandemic Virus）。該文由道格拉斯·約頓（Douglas Jordan）撰寫，記述了科學家如何從1918年流感病亡者遺體上獲取病毒，進行基因排序，重組病毒并且在小白鼠身上實驗，了解這一致命病毒的來龍去脈和致病機理。

阿拉斯加的海邊小村莊布萊維格·米遜的集體大墳墓

開始研究的關鍵地點是阿拉斯加的海邊小村莊布萊維格·米遜，該村莊現有近四百人，1918年感染流感病毒前有八十個成年居民，大多數是因紐特人。疫情發(fā)作時，病毒流傳至這個偏僻小村，或者是坐狗拉雪橇從附近城市來村里售貨的商人，或者是郵遞員帶來的。1918年11月15至20日的短短五天時間內，村里有七十二位成年人死亡。死者全都埋葬在村旁一個小山坡上的集體大墳墓里，長年冰凍狀態(tài)，無人去動，直到1951年。約翰·胡爾?。↗ohan Hultin）是一位瑞典微生物學家，當時二十五歲，是愛荷華大學的博士生。他認為有可能在這個集體墳墓中找到病毒的蹤跡，也許冰封在病死村民的器官組織中。他獲得村中長者的許可發(fā)掘墳墓，參與挖掘工作的還有幾位大學同事。挖掘工作花了幾天時間，他們必須先用篝火融化凍土才能挖掘。因極寒天氣，有些遺體保存不錯，有具小女孩的遺體保存完好，連同身上的藍色連衣裙和頭上的紅色發(fā)帶都原封不動。最后他們共從五具遺體上獲得肺器官組織，千辛萬苦將其從阿拉斯加帶回愛荷華大學的實驗室。當時條件很差，胡爾丁乘坐的是DC-3螺旋槳飛機，中途多次?？考佑?。飛機每次停留他都下飛機用滅火器的二氧化碳來重新冰凍肺器官組織，噪聲引起同機乘客和其他人的側目?；氐綄嶒炇液?，他嘗試將肺組織插入雞蛋中讓病毒生長，最終沒有成功。從網站文章介紹看，當時的實驗條件極為簡單，科學家甚至要用嘴通過吸管將病毒吸取到試管里，現在這種方式已經杜絕。

胡爾?。ㄗ髠龋瑪z于1951年。

胡爾丁1951年在實驗室

直到四十六年之后，胡爾丁才得到第二次機會追蹤病毒。1997年他在《科學》雜志上讀到署名杰弗里·陶本博格（Jeffery Taubenberger）等人的論文——《1918年西班牙流感病毒的初始基因特征》（Initial Genetic Characterization of the 1918 “Spanish” Influenza Virus）。當時陶本博格是位年輕的分子病理學家，就職于華盛頓特區(qū)軍事病理學院。論文談到他和團隊正在給病毒基因組的一部分排序。我們熟悉的DNA是雙鏈結構，決定幾乎所有生物的基本基因特征，而流感的基因組由單鏈核糖核酸（RNA）構成。陶本博格的團隊成功地從當年駐扎在南卡羅萊納州福特杰克遜一位死于流感的二十一歲士兵的肺組織里提取了病毒的RNA。這位士兵1918年9月20日因感染流感和肺炎入院，六天后死亡。當時保留了他的肺組織樣本以備將來研究使用?？茖W家從病毒八個基因部分的四個中排列出病毒RNA的九個片段，這項研究并不代表整個病毒基因組的完整序列，但提供了迄今為止最清楚的病毒畫面?；谶@個1997年組合的病毒序列數據，陶本博格和團隊最初認為病毒是一種新型流感A（H1N1）病毒，源自人類和豬，而非禽類。

胡爾丁致信陶本博格，詢問是否有興趣讓他再次去那個阿拉斯加小村莊獲取流感死者遺體的肺組織，他得到肯定回答一周之后就啟程了。他幾乎沒有什么工具，甚至問妻子借了一把園藝剪刀。他再次獲得村委會許可，并且在當地聘請了幫工參加挖掘。這一趟他自費三千二百美元，共挖掘了五天，成績斐然。

埋葬在七英尺深處凍土中的是一具女子遺體，胡爾丁稱為露西。她生前肥胖，死時大約二十多歲，因流感并發(fā)癥而亡，肺完整地保存在凍土中。胡爾丁將其置于保存液里，運送給陸軍病理學院的陶本博格和同事。十天之后他收到電話確認，從露西的肺組織中獲取了陽性基因物質。這次研究結果發(fā)表在1999年國家科學院2月會議論文集，題為“1918西班牙流感病毒血凝素基因的起源和進化”，陶本博格被列為合作作者。該文描述了如何進行1918病毒的血凝素（HA）基因排序。

陶本博格（左）

流感病毒的HA基因決定病毒HA表面蛋白的性質，這些HA表面蛋白允許流感病毒進入并且感染健康的呼吸道細胞。HA 免疫系統產生的抗體也以HA為靶向來抵抗炎癥?，F代流感疫苗就是通過以流感病毒獨特的HA為靶向來起到作用。1999年的研究中，科學家成功地排列出1918病毒的全部HA基因序列。他們使用了從那位二十一歲士兵、露西和另一位曾駐扎于紐約某兵營的士兵遺體中獲取的病毒RNA片段。這第三位病人1918年9月23日因流感入住軍營醫(yī)院，病情發(fā)展迅速，9月26日因嚴重呼吸衰竭死亡。

基因排序的結果表明1918病毒的原型曾在1900和1915年之間的某個時段感染人類?？茖W家注意到1918病毒的HA基因經過了一些哺乳動物的修改，而非禽類修改，因分析方法不同呈現出更具人類或者豬的特征。葉緣基因分析認為1918病毒的HA位于哺乳動物進化枝的根基之內和周圍，這意味著它可能是所知最早感染哺乳動物的流感病毒的原型或者與其相關。但是研究者也認為病毒有可能從禽類病毒那里獲得其HA，但不能肯定病毒在某種哺乳動物宿主身上適應了多久才最后以流行病形式出現。

1918病毒序列同現有類型最接近的是A/SW/Iowa/30，這是最早的典型豬流感類型。當代禽流感病毒類型與1918流行病毒差異很大，然而研究者沒有1918疫情同時期的禽類病毒類型可作比較。1918病毒的HA1只有四個糖基化位點，不同于現代人類HA，后者通過抗原性漂移而積累了另外五個糖基化位點。糖基化位點是流感病毒起作用的關鍵，而增加的位點則是病毒適應人類宿主的方式。但是研究者沒有發(fā)現1918病毒的HA有任何變異可用來解釋其非同尋常的毒性。

與現代劇毒禽流感類型，例如禽流感A（H5）和（H7）病毒不同，1918病毒的HA不具有“裂解位點”變異，這是公認的劇毒性基因標志。將氨基酸插入HA裂解位點可以使流感病毒在正常宿主細胞外的組織中生長。在缺乏這樣明顯標志的情況下，科學家認為1918病毒的劇毒性可能有多種基因因素。

隨后發(fā)表的論文《1918西班牙流感病毒基因的特征》述了如何進行1918病毒的神經氨酸酶（NA）基因排序。在流感病毒中，神經氨酸酶基因負責編碼病毒NA表面蛋白，流感病毒NA表面蛋白使得流感病毒逃離受到感染的細胞，感染其他細胞，因此在傳播流感感染中起到重要作用。研究者注意到免疫系統也以NA為靶向，針對NA的抗體不能防止炎癥，但的確在相當程度上限制了病毒擴散的能力。

研究者根據從露西遺體上獲得的病毒樣本排列出了1918病毒NA的完整編碼。研究者發(fā)現1918病毒的NA基因與哺乳動物和飛禽流感病毒類型共有多種序列和結構特征。葉緣基因分析表明1918病毒曾經居于哺乳動物和飛禽之間，意味著有可能是在1918疫情不久之前引入哺乳動物。而且，從露西遺體中獲取的1918病毒的NA表明它與隨后所有豬和人類分離物的原型非常相似。

總之，葉緣基因分析似乎表明1918病毒NA的最終來源是自然中的飛禽，但研究者無法確定從禽類源頭過渡到病毒最后流行病形式的路徑。研究者也無法找出1918NA任何一種的單個特征能夠解釋其劇毒性。例如，在一些現代流感病毒中，在氨基酸146中，NA 的一個糖基化位點的缺失導致劇毒性以及病毒攻擊小白鼠的神經系統。但是在1918病毒的NA中并未發(fā)現這種變異。

后續(xù)各種研究還詳述了對病毒其他基因的研究結果（流感病毒有八個基因）。至2005年，科學家最終完成了長達近十年的1918病毒基因組完整排序的全部過程。

胡爾丁在挖掘現場

1918病毒的完整基因組排序全部完成，重組1918病毒鮮活版的必要信息已經就緒。首先需要構建病毒八個基因片段的質粒。質粒是微小的圓環(huán)狀DNA鏈，可以在實驗室放大或復制。這項工作由紐約孟山都醫(yī)學院著名的微生物學家彼得·佩爾斯（Dr. Peter Palese）和阿道爾夫·加西亞-薩斯特（Dr. Adolfo Garcia-Sastre）來完成。佩爾斯的方法使人們可以研究病毒基因結構和功能之間的關系，為重組1918病毒使用的技術鋪墊了道路。在孟山都完成構建質粒之后，將其送到CDC，正式開始病毒重組。

首先要關注安全問題。政府高級官員決定位于亞特蘭大的CDC總部作為重組的地點。CDC執(zhí)行了雙重核準程序：首先是CDC的機構生物安全委員會核準，其次是機構動物保護和使用委員會核準，然后才開始實驗室工作。工作的實施遵循嚴格的生物安全和生物防護措施和設備標準，包括使用加強生物安全三級（BSL-3，即我們現在已經相當熟悉的P3）措施和設備。實驗者的防護包括但不限于使用空氣凈化呼吸器、雙重手套、外科制服、鞋套，在離開實驗室之前必須淋浴。所有與病毒和動物相關的工作必須在二級生物安全工作間操作，實驗室的空氣流有導向操控和過濾，不可能意外溢出實驗室。

作為安全措施之一，CDC中心主任辦公室還決定只有一人能獲得許可進入實驗室承擔這項重組病毒的極其重大責任，任命訓練有素的微生物學家特倫斯·坦佩（Terrence Tumpey）博士承擔這項工作。這項工作還得到美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）的全國過敏和感染疾病研究所的認可和協助。

特倫斯·坦佩曾經是佐治亞州東南家禽研究實驗室的美國農業(yè)部微生物學家，曾跟隨CDC微生物學家和流感專家杰奎琳·卡茲（Jacqueline Katz）從事博士后研究。此時他正式調任CDC專門從事流感病毒，包括1918病毒對人體影響的研究。重組病毒工作2005年夏天開始。為了降低同事和公眾的危險，特倫斯·坦佩被要求單獨進行這項工作，而且只能在同事下班離開實驗室回家之后進行。進入BSL-3E實驗室需要掃描指紋，只有通過掃描他的眼睛虹膜才能打開存儲病毒的冰箱。還要求他每天服用抗流感病毒藥物奧司他韋作為補充防范措施，他還被告知萬一被感染，將被隔離，不能與外界接觸。

特倫斯·坦佩在BSL-3E實驗室

借助反向基因技術，坦佩使用佩爾斯博士此前分別構建的1918病毒的八個基因片段的質粒，將其插入人體腎臟細胞，質粒然后指示細胞重組完整1918病毒的RNA。那年7月，同事們都在不斷詢問他是否獲得了1918病毒。病毒出現在細胞培養(yǎng)基中的那一天具有重大歷史意義。他給同事們發(fā)了一封措辭簡單的郵件：“個人的一小步，人類的一大步?！彼腥硕济靼琢似浜x。接下來是研究和發(fā)現它致命的秘密。

2005年5月開始對重組病毒進行研究，2005年10月7日的《科學》雜志上發(fā)表論文，題為“重組的1918年西班牙流感病毒的特征”，記載了這項研究工作。研究評估了1918病毒的致病機理，進行了小白鼠動物實驗。研究者讓小白鼠感染病毒，觀察和記錄體重下降、病毒復制和百分之五十致死滴定量。還通過反向基因技術，設計了取自1918病毒和當代季節(jié)性流感A（H1N1）病毒的不同的基因組合，稱為“混合重組病毒”作為參照，同時感染其他小白鼠。

完全重組的1918病毒具有驚人的迅速自我復制能力。感染四天之后，在小白鼠肺組織中發(fā)現的1918病毒數量是作為參照的混合重組流感病毒數量的三萬九千倍。1918病毒對小白鼠具有相當高的致命力，有些小白鼠感染病毒后三天之內就死亡，在感染病毒兩天之內體重就下降百分之十三。1918病毒的致命性至少比混合重組病毒高一百倍。實驗表明1918病毒的HA基因在這方面起到了相當大的作用。當1918病毒的HA基因被當代人類季節(jié)性流感A（H1N1）的HA基因替換，并與1918病毒的其他七個基因結合，這樣混合重組的病毒不會致死小白鼠，也不會造成明顯的體重下降。

圖C顯示了1918病毒對小白鼠肺組織的影響

科學家另外進行了實驗來確定1918病毒感染是否還會擴散到小白鼠的其他重要器官，例如腦、心、肝和脾臟。實驗室檢測沒有在這些器官中發(fā)現病毒，說明1918病毒不會對病人造成系統感染。當年1918病毒廣泛記載的影響是肺部嚴重迅速的損害。1918疫情中的病人有肺部充液、嚴重肺炎和肺組織炎癥。在四天之內，感染1918病毒的小白鼠也具有類似的肺部并發(fā)癥，說明這是1918病毒嚴重性的獨具特征。

研究者還采用人肺細胞系來研究1918病毒對肺組織的作用。與小白鼠實驗類似，1918病毒數量迅速倍增，在人肺細胞中擴散，在人肺細胞中產生的病毒數量是作為參照的混合重組病毒的五十倍。這些實驗表明除了HA之外，1918病毒的聚合酶基因在病毒對人肺組織的感染力和毒性上也起到了重要作用。

另外一組實驗意在更好地了解1918病毒可能的禽類源頭。此前陶本博格等人做的實驗表明1918病毒基因片段更接近禽流感A（H1N1）病毒而非在其他哺乳動物身上發(fā)現的H1N1病毒。研究者想知道1918病毒是否像現代禽流感病毒那樣對于受精雞蛋有致命力。用受精十天的雞蛋做實驗表明1918病毒對受精雞蛋具有致命力，正如當代H1N1禽流感病毒。值得注意的是，使用人類季節(jié)性流感A（H1N1）病毒作為參照的實驗對小雞胚胎沒有同樣的毀滅性效果。另外，混合重組的流感病毒分別包含1918病毒二、五或七個基因，也不傷害小雞胚胎。與小白鼠和人肺細胞實驗類似，這些受精雞蛋實驗表明1918病毒的HA和聚合酶基因在其毒性上都起到了重要作用。

研究者確認，病毒的HA和聚合酶PB1病毒基因在其感染力和嚴重性上起到了特別重要的作用。但是選用若干而非全部1918病毒基因混合重組作為參照實驗表明，并非哪一單個病毒構成，而是所有基因組合在一起才使其具有如此高的危險性。相比之下，沒有任何其他用來實驗的人類流感病毒具有如此非同尋常的毒性。因此1918病毒獨具一格，是大自然、進化以及人與動物密切接觸所導致的獨特的致命產物。這也可以預示大自然在未來依舊有能力產生危害公眾健康的重大流行病。

1918年之后，世界經歷了三次大流行病。1957、1968和2009年。1957的H2N2和1968的H3N2兩次流感都導致全球一百萬人死亡，而2009年的H1N1流感第一年死亡人數則不到三十萬。因此人們也懷疑是否還會再次發(fā)生1918年這樣大規(guī)模的流行病?？茖W家認為雖然有這種可能，但畢竟一百年來人類在醫(yī)療、科技和社會條件方面都有了長足進步，能做出更好的準備來應對流行病。

一戰(zhàn)時擁擠的部隊

1918病毒本身固然劇毒，但還有其他因素也導致該病毒肆虐。1918年世界還處于大戰(zhàn)時期，士兵廣泛動員參軍打仗和返鄉(xiāng)等使病毒廣泛傳播；人們居住空間狹小，民間醫(yī)療條件匱乏，當時美國有百分之三十的醫(yī)療人員從軍；應對流行病的醫(yī)療技術和設施有限或基本不存在，沒有診斷技術，沒有疫苗，抗菌素尚未發(fā)明，沒有抗病毒藥品，更沒有重癥監(jiān)護，醫(yī)護人員只能依靠支持手段；沒有地方、城市和國家之間的協同合作，有些地區(qū)只能采取一些緩解手段，例如關閉學校，禁止公共場所聚會，隔離等。

今天人類在健康科技、疾病監(jiān)控、醫(yī)療、醫(yī)藥、疫苗和流行病預防上面取得了很大進步，生產出了感冒疫苗，每年更新，有治療流感的抗病毒藥品，在有可能暴露在病毒感染的情況下，還能用來預防。重要的是現在還有很多抗菌素用于治療細菌感染?，F在有確診流感的測試手段，叫做RIDT，目前測試流感十五分鐘就能有結果，靈敏度達百分之五十到七十。還有“快速分子測定”，比RIDT更快速準確。WHO有全球監(jiān)控網絡，協同各國疾控機構監(jiān)測季節(jié)性流感病毒，監(jiān)測新型流感病毒的出現?？傊?，全球協同合作，廣泛分享信息，應用現代醫(yī)療藥品和設施積極防治病毒感染，是人類應對大流行病的有效手段。

（本文據美國CDC網站刊文The Deadliest Flu: the Complete Story of the Discovery and Reconstruction of the 1918 Pandemic Virus編譯；https://www.cdc.gov/flu/pandemic-resources/reconstruction-1918-virus.html）