酶學(xué)方法：CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN 在創(chuàng)建特異性位點(diǎn)改變基因組中的應(yīng)用

目錄
第1章 Cas9的體外酶學(xué) 1
1.1 導(dǎo)論 1
1.2 Cas9表達(dá)和純化 3
1.3 引導(dǎo)RNA的制備 6
1.4 內(nèi)切核酸酶切割分析 10
1.5 結(jié)束語(yǔ) 13
致謝 14
參考文獻(xiàn) 14
第2章 采用CRISPR/Cas核酸酶和縮短的引導(dǎo)RNA在人體細(xì)胞中靶向基因組編輯 18
2.1 導(dǎo)論 18
2.2 方法 30
利益沖突 39
參考文獻(xiàn) 39
第3章 TALEN、Cas9和其他基因組編輯酶的特異性測(cè)定 42
3.1 導(dǎo)論 43
3.2 方法 56
3.3 結(jié)論 62
致謝 62
參考文獻(xiàn) 63
第4章 定制重組酶基因組工程 69
4.1 導(dǎo)論 70
4.2 靶識(shí)別 71
4.3 重組酶構(gòu)建 73
4.4 重組酶活性的測(cè)定 74
4.5 位點(diǎn)特異性整合 76
4.6 結(jié)論 78
致謝 78
參考文獻(xiàn) 78
第5章 人細(xì)胞基因組工程 81
5.1 導(dǎo)論 82
5.2 人基因組結(jié)構(gòu) 83
5.3 使用可編程核酸酶對(duì)人基因編輯的范圍 85
5.4 可編程核酸酶用于人細(xì)胞基因組編輯 87
5.5 使用可編程核酸酶對(duì)人類遺傳疾病的修復(fù) 89
5.6 使用可編程核酸酶對(duì)人非遺傳疾病的治療 90
5.7 人多能干細(xì)胞基因組工程 91
5.8 可編程核酸酶對(duì)人細(xì)胞的遞送 92
5.9 切口酶修飾人基因組 94
5.10 基因編輯人細(xì)胞的富集 95
5.11 結(jié)論 95
致謝 96
參考文獻(xiàn) 96
第6章 人細(xì)胞基因組編輯 103
6.1 導(dǎo)論 104
6.2 基因打靶策略 104
6.3 核酸酶靶位點(diǎn)的選擇 105
6.4 實(shí)驗(yàn)規(guī)程 106
6.5 可供選擇的方法 112
參考文獻(xiàn) 115
第7章 活細(xì)胞熒光成像技術(shù)標(biāo)記內(nèi)源性基因位點(diǎn)及使用ZFN、TALEN和Cas9進(jìn)行分子計(jì)算 119
7.1 導(dǎo)論 119
7.2 方法 121
7.3 標(biāo)記/編輯局限性 133
7.4 遠(yuǎn)景 134
致謝 135
參考文獻(xiàn) 136
第8章 Cas9切口酶基因組編輯 139
8.1 導(dǎo)論 139
8.2 靶選擇 142
8.3 質(zhì)粒sgRNA構(gòu)建 142
8.4 細(xì)胞系sgRNA的驗(yàn)證 143
8.5 細(xì)胞收獲與DNA提取 144
8.6 錯(cuò)配酶法SURVEYOR缺失分析 144
8.7 使用Cas9n HDR和非HDR插入 146
8.8 HDR和插入事件的分析 147
8.9 疑難問(wèn)題解決 147
致謝 148
參考文獻(xiàn) 148
第9章 DR-GFP報(bào)道基因和Cas9核酸酶分析哺乳動(dòng)物細(xì)胞中斷裂和切口誘導(dǎo)同源重組 150
9.1 導(dǎo)論 151
9.2 克隆切口酶和Cas9催化死亡變種 152
9.3 靶位點(diǎn)選擇和sgRNA構(gòu)建的克隆 155
9.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和流式細(xì)胞儀分析 157
9.5 材料 161
9.6 結(jié)論 161
參考文獻(xiàn) 162
第10章 獲得性CRISPR/Cas9功能基因組篩選 164
10.1 導(dǎo)論 164
10.2 高通量篩選載體設(shè)計(jì)的改良 165
10.3 sgRNA文庫(kù)的構(gòu)建 169
10.4 引導(dǎo)文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo) 174
10.5 關(guān)于篩選設(shè)計(jì)參數(shù)的注意事項(xiàng) 175
10.6 涉及sgRNA文庫(kù)池陽(yáng)性選擇篩選“命中”解碼 177
10.7 結(jié)論 178
參考文獻(xiàn) 178
第11章 人多能干細(xì)胞基因組快速編輯的iCRISPR平臺(tái) 181
11.1 導(dǎo)論 182
11.2 iCas9hPSC的產(chǎn)生 185
11.3 用iCRISPR產(chǎn)生敲除hPSC 194
11.4 用iCRISPR精確改變核苷酸的傳代 202
11.5 用iCRISPR誘導(dǎo)hPSC基因敲除 204
11.6 結(jié)論和前景 206
致謝 208
參考文獻(xiàn) 209
第12章 用Cas9DSB和nCas9配對(duì)切口產(chǎn)生人體細(xì)胞癌癥易位 213
12.1 導(dǎo)論 214
12.2 材料 215
12.3 誘導(dǎo)和檢測(cè)癌癥在人細(xì)胞中易位方法 217
12.4 結(jié)論 228
致謝 229
參考文獻(xiàn) 229
第13章 人類基因治療的基因組編輯 232
13.1 導(dǎo)論 233
13.2 人原代CD4+T細(xì)胞B2M的基因組編輯 234
13.3 用CRISPR/Cas9對(duì)人CD34+CCR5中的CCR5打靶 243
參考文獻(xiàn) 249
第14章 CRISPR/Cas9在大鼠基因組位點(diǎn)特異性突變的產(chǎn)生 252
14.1 原理 253
14.2 設(shè)備 255
14.3 材料 255
14.4 方案 257
14.5 第1步：sgRNA靶寡核苷酸體外轉(zhuǎn)錄 258
14.6 第2步：Cas9mRNA的體外轉(zhuǎn)錄 261
14.7 第3步：假孕雌性大鼠和單細(xì)胞大鼠胚胎的制備 263
14.8 第4步：?jiǎn)渭?xì)胞胚胎顯微注射和假孕大鼠胚胎移植 265
14.9 第5步：創(chuàng)建大鼠的鑒定 269
14.10 第6步：F1代大鼠的產(chǎn)生 273
參考文獻(xiàn) 273
第15章 單質(zhì)粒注射在小鼠中CRISPR/Cas9的基因組編輯 275
15.1 導(dǎo)論 276
15.2 pX330設(shè)計(jì)和CRISPR/Cas9質(zhì)粒構(gòu)建 278
15.3 pX330體外驗(yàn)證 281
15.4 環(huán)形質(zhì)粒注射一步產(chǎn)生突變小鼠 284
15.5 打靶突變小鼠的篩選 285
15.6 結(jié)論 286
致謝 287
參考文獻(xiàn) 288
第16章 CRISPR/Cas9在活細(xì)胞中基因組元件成像 290
16.1 導(dǎo)論 291
16.2 穩(wěn)定表達(dá)dCas9-GFP細(xì)胞系的產(chǎn)生 294
16.3 使用慢病毒載體表達(dá)sgRNA 297
16.4 非重復(fù)序列的標(biāo)記 298
16.5 CRISPR檢測(cè)基因組座的成像 300
16.6 結(jié)論 302
致謝 302
參考文獻(xiàn) 303
第17章 熱帶爪蟾中基于Cas9基因組編輯 305
17.1 導(dǎo)論 305
17.2 原理 306
17.3 方案 308
17.4 討論 317
致謝 319
參考文獻(xiàn) 319
第18章 斑馬魚(yú)中基于Cas9基因組編輯 322
18.1 導(dǎo)論 323
18.2 插入/缺失突變的靶向產(chǎn)生 328
18.3 靶向基因組編輯的其他策略 335
18.4 前景 340
致謝 341
參考文獻(xiàn) 341
第19章 果蠅中基于Cas9基因組編輯 352
19.1 導(dǎo)論 352
19.2 基于CRISPR基因組編輯應(yīng)用和設(shè)計(jì)考慮 353
19.3 CRISPR組分的遞送 356
19.4 CRISPR試劑的配制 359
19.5 突變子的檢測(cè) 363
致謝 369
參考文獻(xiàn) 369
第20章 生殖細(xì)胞注射CRISPR/Cas RNA的無(wú)轉(zhuǎn)基因基因組編輯 373
20.1 理論、哲學(xué)和實(shí)際問(wèn)題 374
20.2 設(shè)備 377
20.3 材料 378
20.4 靶序列識(shí)別 378
20.5 產(chǎn)生sgRNA構(gòu)造 379
20.6 sgRNA的體外合成 381
20.7 hCas9mRNA體外合成 382
20.8 sgRNA和mRNA的注射 384
20.9 CRISPR/Cas突變產(chǎn)生的恢復(fù) 384
參考文獻(xiàn) 385
第21章 擬南芥和煙草中Cas9的基因組編輯 388
21.1 導(dǎo)論 388
21.2 Cas9和sgRNA的表達(dá) 390
21.3 雙sgRNA引導(dǎo)基因組編輯 391
21.4 遠(yuǎn)景 394
21.5 注釋 395
致謝 397
參考文獻(xiàn) 397
第22章 工業(yè)酵母基因組CRISPRm多元工程 399
22.1 導(dǎo)論 400
22.2 質(zhì)粒設(shè)計(jì) 402
22.3 Cas9表達(dá) 403
22.4 引導(dǎo)RNA表達(dá) 403
22.5 篩選方法 405
22.6 結(jié)束語(yǔ) 410
致謝 410
參考文獻(xiàn) 411
第23章 Cas9增強(qiáng)功能蛋白質(zhì)工程 413
23.1 導(dǎo)論 414
23.2 方法 419
23.3 結(jié)論 427
參考文獻(xiàn) 427