實(shí)用神經(jīng)變性疾病生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

第一章　原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞功能測(cè)定　/ 1
第一節(jié)　原代皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 1
第二節(jié)　新生小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元培養(yǎng) 3
一、單層皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞表面培養(yǎng)新生鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元 3
二、單層星形膠質(zhì)細(xì)胞表面培養(yǎng)新生鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元及形成
　　神經(jīng)突觸 9
三、本節(jié)實(shí)驗(yàn)中使用到的試劑和溶液 11
四、注意事項(xiàng) 13
五、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案 13
六、預(yù)期結(jié)果 13
七、時(shí)間因素 14
第三節(jié)　小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 14
一、成年鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 14
二、新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng) 19
三、胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng) 20
第四節(jié)　原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 21
一、星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 21
二、新生鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 23
三、成年鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 25
第五節(jié)　小膠質(zhì)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn) 29
一、趨化和遷移實(shí)驗(yàn) 29
二、體外測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能（吞噬尼羅紅微球/a突觸核蛋白/Ab） 30
第二章　模式動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)　/ 34
第一節(jié)　Morris水迷宮 34
第二節(jié)　Y-迷宮 36
第三節(jié)　小鼠平衡功能實(shí)驗(yàn) 39
第四節(jié)　抑郁模型的建立和評(píng)定 40
一、抑郁癥的模型制作 41
二、抑郁動(dòng)物的行為學(xué)評(píng)價(jià) 45
第五節(jié)　嗅覺(jué)行為功能測(cè)定 47
一、埋藏食物小球?qū)嶒?yàn) 48
二、嗅覺(jué)迷宮 48
第六節(jié)　大腦中動(dòng)脈閉塞模型的建立和評(píng)定 49
第七節(jié)　運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定 52
一、小鼠肢體力量測(cè)試實(shí)驗(yàn)——小鼠抓力測(cè)試 52
二、小鼠耐力測(cè)試實(shí)驗(yàn)——跑臺(tái)實(shí)驗(yàn) 53
第八節(jié)　感覺(jué)（痛觸覺(jué)）系統(tǒng)評(píng)估 54
一、Von Frey Test 54
二、智能熱板儀 56
三、甩尾實(shí)驗(yàn) 57
第三章　神經(jīng)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)　/ 59
第一節(jié)　腦組織的取材、保存和標(biāo)本制作 59
第二節(jié)　脊髓組織的取材、保存和標(biāo)本制作 62
一、脊髓的取材和保存 62
二、 脊髓冰凍切片的制作 64
第三節(jié)　小鼠腦脊液采集 66
第四節(jié)　海馬腦片場(chǎng)電位的神經(jīng)電生理記錄方法 67
第五節(jié)　神經(jīng)免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色 71
第六節(jié)　透視電鏡標(biāo)本制作 74
第七節(jié)　老化組織相關(guān)病理特殊染色（SA-b-gal 、銀染色） 77
一、神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）染色 77
二、b-淀粉樣蛋白染色 80
三、衰老相關(guān)b-半乳糖苷酶染色 82
第八節(jié)　 神經(jīng)組織高爾基染色 83
第九節(jié)　神經(jīng)組織體視學(xué)分析技術(shù) 86
第十節(jié)　共聚焦掃描及定量技術(shù) 92
一、激光共聚焦顯微鏡的成像原理 92
二、激光共聚焦顯微鏡在神經(jīng)變性疾病研究中的運(yùn)用 93
三、激光共聚焦顯微鏡結(jié)構(gòu) 95
四、基本掃描及圖像獲取 95
五、微分干涉差（DIC）掃描及圖像獲取 102
六、拼圖掃描及圖像獲取 103
七、Z-Stack掃描及圖像獲取 103
八、時(shí)間序列掃描 105
九、激光共聚焦圖像定量及后處理 106
第四章　神經(jīng)生化和基因檢測(cè)　/ 115
第一節(jié)　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因型鑒定、保種和管理 115
一、小鼠生殖生理 115
二、小鼠的生長(zhǎng)周期 116
三、基因工程鼠飼養(yǎng)繁殖一般流程和注意事項(xiàng) 116
四、常用小鼠品系的概況 117
五、幾種常用神經(jīng)變性疾病轉(zhuǎn)基因鼠的介紹和鑒定 118
第二節(jié)　神經(jīng)組織蛋白檢測(cè) 125
一、蛋白質(zhì)印跡法 125
二、免疫共沉淀原理及步驟 130
三、動(dòng)物腦組織勻漿檢測(cè)Ab 132
第三節(jié)　RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) 134
一、RNA提取 134
二、RT-PCR 135
三、qPCR 135
第四節(jié)　基因芯片檢測(cè) 140
一、單核苷酸多態(tài)性芯片實(shí)驗(yàn) 140
二、基因表達(dá)譜芯片檢測(cè) 142
第五節(jié)　熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)分析啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性 143
第六節(jié)　熒光定量PCR法檢測(cè)端粒酶活性 146
第七節(jié)　中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸和非突觸線粒體的分離提取 148
第五章　分子影像技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)變性疾病　/ 157
第一節(jié)　PET/SPECT-CT顯像探針的制備 158
第二節(jié)　fMRI成像技術(shù)的原理及其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理 164
一、fMRI實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 164
二、實(shí)驗(yàn)設(shè)備 166
三、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 166
四、fMRI實(shí)驗(yàn)相關(guān)的準(zhǔn)備 169
五、小結(jié) 170
第六章　神經(jīng)變性疾病患者臨床神經(jīng)評(píng)估、樣本保存和數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)　/ 171
第一節(jié)　神經(jīng)變性疾病臨床登記和數(shù)據(jù)庫(kù)建立和實(shí)施 171
一、臨床研究目標(biāo)的確立 171
二、研究方案的確立 172
三、組織機(jī)構(gòu)的建立 173
四、病例報(bào)告表（CRF）的建立 174
第二節(jié)　神經(jīng)變性疾病患者血液、腦脊液組織樣本的保存和處理 177
一、血液及血液成分的處理和保存 178
二、腦脊液的處理和保存 179
三、標(biāo)本DNA的提取和保存 180
　附表6-1　標(biāo)本保存詳細(xì)記錄 180
　附表6-2　關(guān)于使用組織樣本開(kāi)展科學(xué)研究的知情同意書(shū) 181
第三節(jié)　 神經(jīng)心理認(rèn)知障礙測(cè)試診斷系統(tǒng) 182
一、醫(yī)生端系統(tǒng) 182
二、用戶(hù)管理 183
三、臨床病例登記 183
四、案例管理 186
五、統(tǒng)計(jì)打印 190
六、量表管理 191
第七章　神經(jīng)生物學(xué)常用分析及作圖軟件的應(yīng)用　/ 193
第一節(jié)　Image J神經(jīng)生物分析軟件的應(yīng)用 193
一、 Image J神經(jīng)生物分析軟件的基本功能 193
二、 Image J神經(jīng)生物分析軟件分析免疫熒光定量技術(shù) 197
第二節(jié)　Graphpad Prism 6.0作圖和統(tǒng)計(jì)應(yīng)用 205
一、折線圖 205
二、直條圖 208
三、生存曲線圖 216
四、散點(diǎn)圖 219
五、餅圖 225
第三節(jié)　Logistic回歸、Cox風(fēng)險(xiǎn)模型以及Kaplan-Meier曲線的統(tǒng)計(jì)應(yīng)用 231
一、Logistic回歸分析和ROC工作曲線的制訂 231
二、 Cox回歸分析 238
三、Kaplan-Meier曲線分析 242
第四節(jié)　EndNote×7的應(yīng)用 245
一、文獻(xiàn)管理 245
二、論文撰寫(xiě) 245