絲狀真菌分子細胞生物學與實驗技術

前言
第一章 絲狀真菌基因型特征的鑒定
1 概述
2 基因組變異的主要特征
3 確定研究目的
4 用于基因組分析的技術
5 假設
6 選擇最佳策略
方案1 鏈格孢真菌的RAPD分析
7 AFLP技術的原理及其應用
方案2 絲狀真菌的AFLP分析
方案3 絲狀真菌的cDNA-AFLP
8 變性梯度凝膠電泳(DGGE)
方案4 土壤中真菌的DGGE分析
9 重要的數(shù)據(jù)庫和互聯(lián)網(wǎng)資源
第二章 絲狀真菌核酸的提取與分析
1 概述
2 基因組DNA的分離
方案1 CTAB法提取真菌基因組DNA
方案2 氯化芐(benzyl chloride)法提取真菌基因組DNA
方案3 絲狀真菌總DNA的分離
方案4 固體平板上菌小量DNA的塊速提取(以稻瘟病菌為例)
方案5 真菌小量DNA的快速提取
3 絲狀真菌RNA的提取
4 RNA的操作
方案6 Trizol法提取絲狀真菌總RNA
方案7 絲狀真菌總RNA的提取
方案8 真菌總RNA的小量提取(Trizol法)
第三章 絲狀真菌的DNA轉(zhuǎn)化
1 概述
2 選擇性標記和轉(zhuǎn)化載體
3 待轉(zhuǎn)化DNA的質(zhì)量
4 DNA的進入
5 REMI轉(zhuǎn)化
方案1 稻瘟病菌(Maggna porthe grisea)原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化
方案2 毛殼菌原生質(zhì)體的制備
6 真菌ATMT轉(zhuǎn)化
方案3 感受態(tài)農(nóng)桿菌細胞的制備與轉(zhuǎn)化
方案4 利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌
7 電擊轉(zhuǎn)化
方案5 Tapesia yallundae的電擊轉(zhuǎn)化
8 轉(zhuǎn)化DNA的命運
方案6 絲狀真菌中的質(zhì)粒拯救
方案7 農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
第四章 絲狀真菌的遺傳分析
1 子囊菌遺傳分析
方案1 對真菌孢子進行化學誘變
方案2 對真菌的孢子進行紫外誘變
方案3 營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選與鑒定
方案4 溫度敏感型突變?nèi)后w的制備
方案5 單孢分離
方案6 構(gòu)巢曲霉的八分體分析
方案7 通過準性重配確定里連鎖群
方案8 稻瘟病菌溫度敏感型突變體的篩選
2 擔子菌遺傳分析
方案9 鬼傘菌在人工培養(yǎng)條件子實體和擔孢子的產(chǎn)生
方案10 通過CHEF凝膠電泳分離C.cinereus的染色體
方案11 C.cinereus的四分體分離
方案12 C.cinereus粉孢子的紫外誘變
方案13 利用NT、G(MNNG)/EMS對擔子菌進行誘變
方案14 平板印跡
附：擔子菌研究中的標準培養(yǎng)基
第五章 絲狀真菌的基因組分析
1 概述
2 遺傳圖譜
方案1 克隆固定大小的基因組DNA作為RFLP探針
方案2 RAPD操作要點
3 電泳核型分析
方案3 瓊脂糖栓中制備完整染色體DNA
方案4 瓊脂糖栓電泳
方案5 鉗位均勻電場電泳
4 物理圖譜
方案6 染色體DNA的RecA-AC
方案7 準備BAC載體DNA
方案8 準備BAC插入DNA
方案9 BAC插入DNA大小的選擇，恢復和克隆
方案10 將文庫克隆排列到雜交膜上
方案11 收集克隆文庫
5 篩選文庫
方案12 Southern雜交分析混合文庫和克隆陣列文庫
6 染色體步移(chromosome walking)
方案13 BAC或者黏粒末端RNA探針的合成
方案14 根據(jù)插入片段末端序列制備的探針
7 真菌基因組分析相關數(shù)字資源
第六章 真菌發(fā)育過程的細胞學分析
1 概述
2 絲狀真菌生長的測定
方案1 菌絲頂端生長的測定
方案2 菌落生長速度的測定
方案3 直線生長速率的測定
3 絲狀真菌孢子的萌發(fā)
方案4 真菌孢子的萌發(fā)測定
4 稻瘟病菌細胞生物學分析
方案5 稻瘟病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)、孢子收集和附著胞誘導培養(yǎng)
方案6 稻瘟病菌侵染過程的組織病理學觀察
方案7 稻瘟病菌孢子、附著胞內(nèi)脂質(zhì)體、糖原的觀察
方案8 細胞自噬現(xiàn)象的觀察
方案9 酒精氧化酶活性測定
方案10 冷凍替代用于電子顯微鏡觀察
方案11 細胞核，細胞壁和隔膜的染色
第七章 絲狀真菌的信號傳導
1 概述
2 蛋白抽提
方案1 構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)蛋白激酶的抽提
3 蛋白免疫沉淀反應
方案2 NIMA在大腸埃希菌(E.coli)中的表達和His-tag親和純化
方案3 蛋白質(zhì)免疫沉淀(IP)
4 凝膠阻滯試驗(gel-shift assay)檢測蛋白的磷酸化狀態(tài)
方案4 NIMA磷酸化狀態(tài)的凝膠忸滯試驗
5 蛋白激酶的底物特異性分析
方案5 NIMA激酶分析
第八章 絲狀真菌的細胞生物學技術
1 電子顯微鏡工作原理及其應用
2 掃描電子顯微鏡樣品制備的原理與方法
3 透射電子顯微鏡樣品制備的原理與方法
4 電鏡細胞化學技術
5 免疫組化技術
第九章 絲狀真菌的生化研究方法
1 概述
2 抽提物的準備
方案1 菌絲的搖瓶培養(yǎng)
方案2 疏水蛋白的分離
3 細胞組分的準備
方案3 細胞膜的分離
方案4 脈孢霉的液泡分離
方案5 線粒體的分離
方案6 細胞核的分離
方案7 細胞核的抽提
方案8 微體的分離
4 蛋白分析
方案9 孢子和菌絲的小量的蛋白質(zhì)抽提
方案10 從固體培養(yǎng)物中分離胞外酶(N.crassa的脂肪酶)
方案11 從新鮮菌絲分離細胞內(nèi)蛋白，適用于蛋白水解敏感蛋白的方法
方案12 從新鮮菌絲分離細胞內(nèi)蛋白
方案13 從凍干菌絲分離胞內(nèi)蛋白
方案14 酶學分析的代謝物抽提
第十章 真菌研究中的免疫學方法
1 概述
2 免疫原分子的特性
方案1 免疫抗原的準備
3 制備多克隆抗血清
方案2 用辛酸和硫酸銨沉淀法純化抗體
方案3 用ELISA測定pAb的滴度和檢驗上清液中的mAb
4 制備單克隆抗體
方案4 通過B細胞-骨髓瘤細胞融合制取鼠科雜種瘤細胞
方案5 熒光免疫檢測
方案6 限制性稀釋法亞克隆
方案7 冷凍法長期儲存的雜交瘤細胞
方案8 應用抗原介導ELISA鑒定Ig類別/亞類
5 蛋白質(zhì)和糖類抗原決定簇的特性
方案9 通過化學和酶學修飾確定的抗原決定簇的特性
6 其他經(jīng)常使用的免疫學分析方法
方案10 間接DAS-ELISA
7 抗體的提供及其商業(yè)發(fā)展
第十一章 絲狀真菌的功能基因組分析
1 構(gòu)建稻瘟病菌突變子庫
2 目標突變技術
3 cDNA文庫構(gòu)建及測序分析
方案1 構(gòu)建附著胞cDNA文庫的cDNA的合成
4 cDNA文庫構(gòu)建及篩選
方案2 cDNA文庫構(gòu)建
方案3 質(zhì)粒pTriplEx2的插入片段的驗證
5 抑制差減雜交技術
方案4 稻瘟病菌附著胞SSF{差減文庫的構(gòu)建
6 絲狀真菌細胞自噬及其研究方法
方案5 稻瘟病菌中細胞自噬研究方法
方案6 稻瘟病菌細胞自噬研究中的其他相關顯微觀察
方案7 雙分子熒光互補技術
方案8 蛋白質(zhì)電泳(Tricine-SDS-PAGE)及蛋白質(zhì)印跡雜交
方案9 酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白互作
方案10 細胞表達目的蛋白
7 真菌中結(jié)合PCR(Double-Joint PCR)基因融合片段操作
8 真菌RNAi技術的應用
第十二章 絲狀真菌分子進化與系統(tǒng)發(fā)育分析
1 概述
2 系統(tǒng)發(fā)育分析方法
方案1 木霉菌的ITS rDNA的PCR擴增
方案2 木霉菌的tef 1-α基因的PCR擴增
方案3 木霉菌進行RAPD研究
方案4 AFLP技術
3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹
第十三章 絲狀真菌群體遺傳分析
1 純培養(yǎng)條件下真菌群體遺傳分析
方案1 Pot2-rep-PCR
方案2 MGR586-RFLP
2 免培養(yǎng)技術用于環(huán)境中真菌群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析
方案3 土壤真菌DNA的直接提取
方案4 土壤樣品中真菌總DNA的提取
第十四章 真菌分子生物信息學常用軟件的使用
1 概述
2 文件格式
3 FASTA格式
4 Tab(或其他分隔符)分隔的行文件
5 BLAST
6 Primer Premier 5
7 e-PCR
8 Clustal
9 BioEdit
10 Staden Package
參考文獻