大豆在暗誘導(dǎo)下光周期及衰老相關(guān)基因的差異表達(dá)研究

　　《大豆在暗誘導(dǎo)下光周期及衰老相關(guān)基因的差異表達(dá)研究》講述了：黑龍江省是我國大豆主要生產(chǎn)基地，加入世貿(mào)組織后，大豆面臨嚴(yán)重的進(jìn)口壓力。主要原因是我國大豆單產(chǎn)低，競爭力不強(qiáng)。大豆屬于短日照植物，其生長發(fā)育對光周期反應(yīng)非常敏感，這一特性嚴(yán)重阻礙大豆品種的適應(yīng)性，是制約大豆單產(chǎn)提高和穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵因素。暗處理相當(dāng)于短日照，可以縮短大豆的開花和成熟期，其表型之一是加速葉片的衰老。葉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、代謝和基因表達(dá)都協(xié)調(diào)的發(fā)生變化，細(xì)胞器官的組分被依次有序的分解。代謝變化包括合成代謝活性的減弱，如光合作用和蛋白質(zhì)的合成，以及分解代謝的加速，如核酸降解和蛋白水解。這些對維持植物生長和生殖是非常必要的，基因轉(zhuǎn)錄物豐度的巨大變化揭示了從有光合活性的葉片到作為流動營養(yǎng)物來源的衰老器官來維持發(fā)育的轉(zhuǎn)變情況。為了打破大豆種植區(qū)域的局限性，本研究在細(xì)胞分子水平上從基因差異表達(dá)的角度研究短日照光周期誘導(dǎo)開花和衰老過程中基因轉(zhuǎn)錄豐度的變化，克隆與大豆光周期反應(yīng)及衰老有關(guān)的基因，從而探索大豆葉片感受日長變化誘導(dǎo)開花和衰老的復(fù)雜機(jī)制。雖然植物花器官的分化發(fā)生在頂端分生組織，在開花過程中的基因表達(dá)也必然在頂端分生組織中有所反映，然而植物感受光的器官是葉片，并利用長距離信號通過韌皮部傳導(dǎo)至頂端分生組織（SAM）影響生殖生長，在光周期控制開花過程中也必然牽涉葉片中很多基因的互作。由于黑暗的長度是開花時間的關(guān)鍵決定因素，在光周期控制開花過程中基因可能在夜間表達(dá)有差異，所以，以晝夜交替時的大豆的兩個樣本的葉片為研究目的對象，構(gòu)建了差異表達(dá)的cDNA消減文庫，發(fā)現(xiàn)與暗誘導(dǎo)相關(guān)的差異表達(dá)基因，揭示了有關(guān)參與機(jī)體暗適應(yīng)下蛋白質(zhì)的上調(diào)表達(dá)的信息，為進(jìn)一步分離暗處理產(chǎn)生差異表達(dá)基因奠定了基礎(chǔ)。通過轉(zhuǎn)化短日照煙草，進(jìn)行光周期反應(yīng)基因的功能驗證，分析該類基因在光周期反應(yīng)中的作用。同時，研究外源激素的施加對光周期途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的影響；分析開花誘導(dǎo)中基因組織特性的表達(dá)情況。本研究的宗旨是通過基因的克隆和改造，試圖從根本上改變大豆對光的敏感性，為大豆高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)提高尋找新的突破口，從根本上扭轉(zhuǎn)我國大豆依賴于進(jìn)口的被動局面。主要結(jié)果如下。1.本試驗首次應(yīng)用抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)以東農(nóng)u3大豆的短日照（8h光/16h暗）和長日照（16h光/8h暗）兩個樣本為研究目的對象，構(gòu)建了含有1738個克隆的差異表達(dá)的cI）NA消減文庫，對148個克隆進(jìn)行測序，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了76個與暗誘導(dǎo)相關(guān)的差異表達(dá)ESTs（上調(diào)至少3倍），根據(jù)Blastn和Blastx推測這些ESTs的功能包括參與轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)類蛋白；參與大分子降解的酶類如蛋白和核酸的降解、參與細(xì)胞壁修飾的合成代謝、初級代謝以及次級代謝的酶類和解毒與防衛(wèi)的壓力反應(yīng)的基因。揭示了有關(guān)參與機(jī)體暗適應(yīng)下蛋白質(zhì)的上調(diào)表達(dá)的信息，為進(jìn)一步分離短日處理產(chǎn)生差異表達(dá)基因奠定了基礎(chǔ)。2.為了研究GmRAV在大豆短日照信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的可能作用，我們利用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)從大豆中克隆了編碼GmRAv的cDNA序列。序列分析結(jié)果表明，GmRAV基因編碼351個氨基酸，含有AP2/ERF和B3結(jié)構(gòu)域，GenBank登陸號為DQ147914，其DNA序列與辣椒、水稻和擬南芥RAV基因高度同源。3.Real-time RT-PCR分析在短日照和長日照條件下大豆葉片中GmRAV基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的豐度變化，表明該基因的豐度在短日照（SD）時都要顯著高于在長日照（LD）條件下的豐度。4.分析GmRAV基因在不同組織中mRNA轉(zhuǎn)錄物的豐度變化表明，SD強(qiáng)烈誘導(dǎo)GmRAV基因在葉、根和莖中的表達(dá)。5.構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-GmRAV，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草過量表達(dá)該基因，獲得卡那霉素抗性植株54株。PCR方法鑒定Tn轉(zhuǎn)基因株系，獲得18個轉(zhuǎn)基因的PCR陽性植株。通過Northern分析表明這4株轉(zhuǎn)基因煙草中的GmRAV基因都轉(zhuǎn)錄，表明它們都已成功轉(zhuǎn)入煙草中，并正常表達(dá)。6.GmRAV過量表達(dá)的煙草植株與對照相比無論在長日照和短日照下植株都明顯矮小，節(jié)間距短，節(jié)數(shù)少，并且在土壤中生長時葉片更深綠，葉片小，GmRAV過量表達(dá)對莖和葉的發(fā)育以及植株的生長有推遲抑制作用。轉(zhuǎn)大豆GmRAV基因的煙草植株無論在長日照和短日照條件下均表現(xiàn)出開花延遲的特征，并且光周期敏感性增強(qiáng)，非轉(zhuǎn)基因煙草在長日照比短日照條件下開花提前3天，而GmRAV過表達(dá)的煙草植株在長日照比短日照條件下開花卻提前13天。7.GmRAV是BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制因子，GmRAV基因通過抑制BR信號而抑制植物細(xì)胞伸長從而抑制生長，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株矮化。8.GmRAV是GA生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的促進(jìn)因子，是ABA和黑暗促進(jìn)衰老途徑中的促進(jìn)因子。

　　趙琳（1980- ），女，黑龍江省鶴崗市人，博士，助理研究員。主要從事大豆生物技術(shù)研究，2007年至今工作于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/大豆生物學(xué)省部共建教育部重點實驗室。在利用抑制性消減雜交技術(shù)尋找差異表達(dá)基因、基因克隆、生物信息學(xué)、植物組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因品種培育研究方面取得一定的成績。