現(xiàn)代毒理學(xué)實驗技術(shù)原理與方法

第一章離體器官的灌流技術(shù)1
第一節(jié)離體肺灌流技術(shù)1
一、儀器裝備1
二、灌流液體1
三、通氣氣體2
四、操作步驟2
五、毒理學(xué)應(yīng)用舉例2
六 、注意事項3
第二節(jié)離體心臟灌流技術(shù)3
一、儀器裝置4
二、灌流液的配制5
三、心臟灌流的應(yīng)用實例6
第三節(jié)離體肝臟灌流技術(shù)6
一、儀器裝置7
二、灌流液的配制8
三、離體肝臟灌流程序8
四、灌流肝臟可用性的鑒定8
五、離體肝臟灌流的應(yīng)用及實例9
第四節(jié)人胎盤灌流技術(shù)10
一、胎盤灌流11
二、結(jié)果及計算13
三、鋅的體外人胎盤灌流研究15
主要參考文獻17
第二章細(xì)胞毒理學(xué)研究方法20
第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)20
一、培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)20
二、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)21
三、常用幾種細(xì)胞的培養(yǎng)26
第二節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的生物特征與檢測29
一、培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)觀察29
二、細(xì)胞染色體分析31
三、培養(yǎng)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化35
四、大鼠氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗38
五、雞胚絨毛膜（抗）新生血管形成試驗40
主要參考文獻43
第三章組織學(xué)方法45
第一節(jié)光鏡和電鏡的制片技術(shù)45
一、光鏡切片的制備45
二、常用組織學(xué)染色法48
三、電鏡超薄切片的制備51
第二節(jié)酶組織化學(xué)技術(shù)53
一、水解酶53
二、氧化酶與過氧化物酶59
三、脫氫酶和一氧化氮合酶61
第三節(jié)免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)63
一、熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué)法64
二、酶標(biāo)記免疫組織化學(xué)法65
三、金標(biāo)記免疫組織化學(xué)法69
四、免疫電子顯微鏡技術(shù)71
主要參考文獻73
第四章細(xì)胞凋亡常用的研究方法74
第一節(jié)概述74
第二節(jié)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)評價76
一、倒置顯微鏡和光學(xué)顯微鏡觀察法76
二、熒光顯微鏡觀察法77
三、透射電子顯微鏡觀察79
第三節(jié)細(xì)胞凋亡時質(zhì)膜的改變80
一、磷脂酰絲氨酸外化分析（Annexin V聯(lián)合PI法）80
二、Hoechst 33342/PI雙染色法81
第四節(jié)細(xì)胞凋亡時DNA的改變81
一、DNA Ladder測定81
二、大分子染色體DNA片段的測定83
三、凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞儀分析84
四、DNA片段原位標(biāo)記85
五、凋亡細(xì)胞斷裂核小體DNA的免疫化學(xué)測定88
第五節(jié)細(xì)胞凋亡時線粒體膜電位變化的檢測89
一、線粒體跨膜電位的檢測89
二、與線粒體膜電位有關(guān)的因素90
第六節(jié)其他90
一、Caspase3活性的檢測90
二、PARP活性的測定93
三、人類凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達和細(xì)胞定位分析94
四、凋亡相關(guān)基因的檢測95
主要參考文獻96
第五章亞細(xì)胞組分的制備與功能檢測97
第一節(jié)細(xì)胞膜的制備97
一、紅細(xì)胞膜的分離與鑒定97
二、肝細(xì)胞膜的分離與鑒定99
三、腦突觸體膜的分離制備101
第二節(jié)腎小管和小腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜的制備102
一、腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣膜的分離與鑒定102
二、小腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜的分離與鑒定106
第三節(jié)線粒體的分離制備107
一、腦線粒體的分離及鑒定108
二、心臟線粒體的分離制備109
三、肝臟線粒體的分離制備109
四、腎臟線粒體的分離制備110
第四節(jié)微粒體的制備及微粒體酶系的測定110
一、微粒體的分離制備110
二、微粒體混合功能氧化酶系活性的測定111
第五節(jié)溶酶體和過氧化氫酶體的分離制備112
一、原理112
二、儀器與試劑112
三、分離技術(shù)113
四、溶酶體純度鑒定113
主要參考文獻114
第六章蛋白質(zhì)（酶）的分離與純化116
第一節(jié)蛋白質(zhì)（酶）的粗分離116
一、細(xì)胞破碎和蛋白質(zhì)（酶）的溶劑提取方法116
二、鹽析方法118
三、有機溶劑沉淀方法121
第二節(jié)蛋白質(zhì)（酶）的層析純化122
一、吸附層析方法122
二、離子交換層析方法122
三、凝膠過濾層析方法124
四、親和層析方法127
五、金屬螯合層析方法130
第三節(jié)電泳技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)（酶）132
一、醋酸纖維素電泳132
二、聚丙烯酰胺凝膠電泳134
三、雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳136
主要參考文獻138
第七章蛋白質(zhì)（酶）的功能測定139
第一節(jié)酶的功能測定139
一、膽堿酯酶的活性測定　140
二、O6烷基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶的測定143
三、超氧化物歧化酶的測定145
四、細(xì)胞色素P450單加氧酶測定146
五、乳酸脫氫酶同功酶測定148
六、附：蛋白質(zhì)定量測定（Lowry法）149
第二節(jié)蛋白質(zhì)受體功能的測定151
一、受體放射分析法151
二、基因重組檢測系統(tǒng)152
第三節(jié)蛋白加合物測定153
一、血紅蛋白加合物的測定154
二、白蛋白加合物的測定155
第四節(jié)蛋白質(zhì)（酶）功能研究新進展157
一、質(zhì)譜技術(shù)157
二、酵母雙雜交技術(shù)158
三、蛋白芯片技術(shù)159
主要參考文獻160
第八章分子毒理學(xué)基本技術(shù)162
第一節(jié)核酸的印跡雜交162
一、核酸雜交的基本原理——核酸的變性和復(fù)性162
二、核酸雜交的重要工具——核酸探針163
三、常用的核酸分子雜交技術(shù)165
第二節(jié)蛋白質(zhì)印跡雜交169
一、蛋白質(zhì)樣品的制備169
二、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳170
三、蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移171
四、蛋白質(zhì)的雜交172
第三節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)173
一、參與PCR反應(yīng)體系的因素及其作用174
二、PCR反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)176
三、常用的幾種PCR反應(yīng)177
第四節(jié)基因的序列測定179
一、雙脫氧鏈末端終止法179
二、化學(xué)（裂解）法181
第五節(jié)重組DNA技術(shù)181
一、基因工程的重要工具——酶類182
二、基因工程的重要工具——載體183
三、獲得目的基因185
四、目的基因與載體的連接187
五、重組子導(dǎo)入受體菌189
六、重組子的篩選與鑒定189
七、重組體在宿主細(xì)胞中表達與調(diào)控190
八、表達產(chǎn)物——蛋白質(zhì)的分離與純化193
主要參考文獻194
第九章分子毒理學(xué)技術(shù)的應(yīng)用195
第一節(jié)單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)195
一、檢測機理195
二、實驗程序及方法195
三、結(jié)果評價197
四、SCGE實驗中的注意事項197
五、SCGE在毒理學(xué)中的應(yīng)用198
第二節(jié)熒光原位雜交（FISH）技術(shù)199
一、基本原理199
二、FISH技術(shù)的發(fā)展199
三、毒理學(xué)研究中應(yīng)用的FISH技術(shù)201
四、FISH技術(shù)中的注意事項202
五、FISH操作舉例202
第三節(jié)PCRSSCP技術(shù)203
一、基本原理204
二、基本實驗過程204
三、影響因素205
四、銀染顯色法205
五、PCRSSCP分析在毒理學(xué)中的應(yīng)用206
第四節(jié)mRNA差異顯示PCR技術(shù)206
一、基本原理207
二、主要操作步驟及注意事項207
三、該技術(shù)的不足之處及彌補辦法208
四、mRNA差異顯示法在毒理學(xué)中的應(yīng)用209
主要參考文獻209
第十章基因芯片技術(shù)210
第一節(jié)基因芯片的原理和合成方法210
一、基因芯片的原理210
二、基因芯片的離片合成法210
三、基因芯片的在片合成法211
四、基因芯片的基質(zhì)212
五、基因芯片的微排列制作212
六、基因芯片的生化反應(yīng)212
七、基因芯片的結(jié)果檢測與分析213
第二節(jié)基因芯片的分類213
一、載體材料分類213
二、點樣方式分類214
三、DNA種類分類214
四、用途分類215
五、新近發(fā)展的兩種芯片技術(shù)215
第三節(jié)基因芯片的廣泛應(yīng)用216
一、在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究方面的應(yīng)用216
二、在藥物篩選方面的應(yīng)用217
三、在指導(dǎo)用藥方面的應(yīng)用217
四、在臨床診斷方面的應(yīng)用217
五、在衛(wèi)生毒理學(xué)研究中的應(yīng)用217
六、在其他方面的應(yīng)用219
主要參考文獻219
第十一章信號傳遞與細(xì)胞通訊220
第一節(jié)細(xì)胞間縫隙連接通訊的檢測220
一、劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)（SLDT）220
二、顯微注射染料示蹤技術(shù)222
三、代謝合作檢測法224
第二節(jié)細(xì)胞膜受體的分離與純化225
一、概述225
二、受體溶脫226
三、受體純化228
第三節(jié)第二信使系統(tǒng)230
一、磷脂酶A2230
二、蛋白激酶C活性測定232
三、環(huán)核苷酸233
四、三磷酸肌醇的檢測234
五、一氧化氮及合酶的測定235
六、二酰甘油的測定241
七、細(xì)胞內(nèi)pH值的測定243
主要參考文獻245
第十二章免疫毒理學(xué)方法246
第一節(jié)B淋巴細(xì)胞功能檢測方法246
一、空斑形成細(xì)胞檢測方法246
二、血清溶血素測定249
第二節(jié)T淋巴細(xì)胞功能檢測方法250
一、小鼠外周血T淋巴細(xì)胞酸性α醋酸萘酯酶（ANAE）染色法250
二、T淋巴細(xì)胞亞群的檢測252
三、T淋巴細(xì)胞增殖功能測定254
四、遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗256
第三節(jié)巨噬細(xì)胞功能測定256
一、巨噬細(xì)胞非特異性吞噬功能測定257
二、巨噬細(xì)胞Fc受體功能檢測258
三、腫瘤壞死因子（TNF）的測定260
四、一氧化氮生成的測定261
第四節(jié)中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞活性測定262
一、中性粒細(xì)胞吞噬功能的測定262
二、NK細(xì)胞活性的測定262
第五節(jié)細(xì)胞因子的測定264
一、白細(xì)胞介素1（IL1）的檢測264
二、白細(xì)胞介素2（IL2）的檢測265
第六節(jié)過敏反應(yīng)和自身免疫266
一、皮膚致敏試驗266
二、小鼠耳腫脹試驗268
三、耳淋巴結(jié)試驗268
四、窩淋巴結(jié)實驗269
第七節(jié)宿主抵抗力試驗270
一、腫瘤細(xì)胞攻擊試驗271
二、對細(xì)菌的抵抗試驗272
三、對旋毛蟲螺旋體的抵抗試驗274
主要參考文獻275
第十三章行為毒理學(xué)方法276
第一節(jié)動物行為評價方法276
一、一般行為毒理學(xué)方法276
二、行為致畸學(xué)方法279
三、神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展與行為毒理學(xué)283
第二節(jié)人的行為功能評價方法289
一、發(fā)展概況289
二、研究方法290
主要參考文獻292
第十四章毒理學(xué)指標(biāo)的統(tǒng)計分析方法294
第一節(jié)聯(lián)合作用的統(tǒng)計方法294
一、比值法294
二、效應(yīng)圖解法295
三、等概率和曲線法295
四、Logistic圖解法297
第二節(jié)存活壽命表的統(tǒng)計指標(biāo)299
一、存活壽命表的統(tǒng)計指標(biāo)299
二、計算步驟300
第三節(jié)生殖發(fā)育試驗的統(tǒng)計指標(biāo)301
一、試驗動物與劑量301
二、生殖發(fā)育的統(tǒng)計指標(biāo)301
三、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價302
第四節(jié)致突變試驗的統(tǒng)計指標(biāo)302
一、概述302
二、實例305
第五節(jié)致癌試驗的數(shù)學(xué)模式示例307
一、幾項指標(biāo)307
二、實例307
第六節(jié)行為毒理學(xué)308
第七節(jié)毒理學(xué)相關(guān)學(xué)科的統(tǒng)計分析指標(biāo)310
一、數(shù)據(jù)類型310
二、體重與器官重量311
三、臨床化學(xué)312
四、血液學(xué)313
五、組織病理學(xué)損害的發(fā)生率314
第八節(jié)樣品與染毒方式的統(tǒng)計問題315
一、經(jīng)食物和空氣染毒分析315
二、懸浮顆粒物統(tǒng)計量315
第九節(jié)對毒理學(xué)數(shù)據(jù)處理中常見錯誤的分析317
一、統(tǒng)計學(xué)結(jié)論的描述性錯誤318
二、隨機分組不均衡318
三、非參數(shù)資料不能用參數(shù)統(tǒng)計方法分析318
四、配對關(guān)系318
五、計量資料中方差是否整齊及計數(shù)資料中樣本是否足夠大319
六、有順序關(guān)系的計數(shù)資料319
七、有效數(shù)字的取舍319
主要參考文獻320
第十五章毒理學(xué)良好實驗室規(guī)范322
一、概述322
二、良好實驗室規(guī)范323
三、附言326
主要參考文獻326