基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程

     目 錄
   緒論
   本教程基因工程實(shí)驗(yàn)流程圖
   實(shí)驗(yàn)一 堿法抽提質(zhì)粒DNA
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）克隆載體pUC118質(zhì)粒與宿主菌MV1184
    1pUC118質(zhì)粒結(jié)構(gòu)
    2MV1184宿主菌F＇因子基因型
    3MV1184宿主菌染色體基因型
    （二）質(zhì)粒DNA的抽提
    1裂解細(xì)胞
    2分離
    3純化
    （三）堿法抽提的主要試劑
    （四）抽提產(chǎn)量與試劑用量的估算
    1抽提產(chǎn)量估算
    2試劑用量估算
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)二 電泳法測定DNA的濃度與純度
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）瓊脂糖凝膠
    （二）電泳時(shí)DNA遷移的影響因素
    1DNA分子質(zhì)量的影響
    2DNA構(gòu)型的影響
    3膠濃度的影響
    4電場強(qiáng)度的影響
    5溴乙錠的影響
    6電泳緩沖液的影響
    7堿基組成與電泳溫度的影響
    （三）電泳緩沖液
    1TAE
    2TBE
    3TPE
    （四）上樣液
    （五）上樣量的控制
    （六）DNA電泳條帶的檢測
    （七）電泳的分子質(zhì)量梯度標(biāo)志
    1線狀分子質(zhì)量梯度標(biāo)志
    2超螺旋分子質(zhì)量梯度標(biāo)志
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)三 載體與供體DNA的酶切
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)
    1一般限制酶的識別位點(diǎn)
    2識別超長堿基序列的酶
    3各類粘性末端的特點(diǎn)
    4同識別序列的酶
    5酶切反應(yīng)中的位點(diǎn)優(yōu)先現(xiàn)象
    6DNA構(gòu)型對酶切的影響
    7近末端切割
    8酶的星號反應(yīng)
    9大腸桿菌中甲基化現(xiàn)象對酶切的影響
    10能切割單鏈的限制酶
    （二）限制性內(nèi)切酶的使用
    1制作基因圖譜
    2克隆基因
    3制備探針
    （三）酶切方式
    1部分酶切
    2完全酶切
    （四）酶的質(zhì)量鑒定
    （五）酶的保存
    （六）酶單位的定義
    （七）限制酶的作用條件
    1作用溫度
    2緩沖體系
    3反應(yīng)時(shí)間
    4DNA的純度與濃度
    （八）終止酶反應(yīng)的方法
    （九）酶切失敗的原因及處理的方法
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)四 目的基因片段的回收
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）各類回收方法
    1電泳回收法
    2收集孔電泳回收法
    3機(jī)械破碎凝膠回收法
    4溶（熔）膠回收法
    5瓊脂糖酶降解凝膠回收法
    （二）回收方法的選擇與操作注意事項(xiàng)
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)五 載體與供體DNA的連接
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）早期的連接理論
    （二）近期的計(jì)算機(jī)模擬反應(yīng)進(jìn)程
    （三）連接酶
    （四）連接反應(yīng)的影響因素
    1連接緩沖液的影響
    2pH值的影響
    3ATP濃度的影響
    4連接溫度與時(shí)間的影響
    5酶濃度的影響
    6DNA濃度的影響
    7DNA序列的影響
    8其他抑制因素的影響
    （五）三種連接酶單位定義
    1Weiss單位
    2d（A—T）環(huán)化單位
    3粘性末端單位
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)六 CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）各種轉(zhuǎn)化方法與轉(zhuǎn)化率的衡量指標(biāo)
    （二）轉(zhuǎn)化率的影響因素
    1試劑（包括水）純度與器皿清潔程度的影響
    2接種前菌種保存方式的影響
    3宿主菌生長時(shí)期的影響
    4CaCl2法0℃放置時(shí)間的影響
    5化合物與無機(jī)離子的影響
    6質(zhì)粒大小、構(gòu)型與復(fù)制起點(diǎn)的影響
    7競爭DNA的影響
    8共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的影響
    9質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)化細(xì)胞比例的影響
    10菌株基因型recA＋與recA 的影響
    11連接緩沖液的影響
    （三）大腸桿菌中的限制系統(tǒng)與限制修飾系統(tǒng)
    1Mcr限制系統(tǒng)
    2Mrr限制系統(tǒng)
    3hsd限制修飾系統(tǒng)
    （四）宿主菌的選擇
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)七 酚/氯仿法快速鑒定轉(zhuǎn)化子
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）DNA水平檢測
    1快速抽提電泳分析
    2快速抽提酶切分析
    3原位雜交法
    4斑點(diǎn)雜交法
    5Southern雜交法
    6DNA序列分析
    （二）mRNA水平檢測
    1R環(huán)電子顯微鏡法檢測
    2雜交抑制翻譯
    3雜交選擇翻譯
    （三）蛋白質(zhì)水平檢測
    1沉淀免疫檢測法
    2其他免疫檢測法
    （四）功能水平檢測
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)八 隨機(jī)引物法標(biāo)記DNA探針
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）酶法標(biāo)記于鏈上
    1缺口轉(zhuǎn)移法
    2隨機(jī)引物法
    3PCR法
    （二）酶法標(biāo)記于末端
    13′末端標(biāo)記法
    25＇末端標(biāo)記法
    （三）化學(xué)法標(biāo)記于鏈上
    1直接標(biāo)記法
    2介導(dǎo)標(biāo)記法
    （四）化學(xué)法標(biāo)記于末端
    1合成時(shí)引入氨基或巰基
    2合成后引入氨基或巰基
    （五）光化學(xué)法標(biāo)記于鏈上
    1芳香疊氮化合物
    2呋喃香豆素衍生物
    （六）人工合成于鏈上
    1摻入堿基類似物
    2摻入核糖類似物
    （七）檢測酶直接標(biāo)記法
    1檢測酶直接標(biāo)記于鏈上
    2檢測酶直接標(biāo)記于末端
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)九 菌落原位吸印
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）各類吸印膜
    1硝酸纖維素膜（NC膜）
    2疊氮氧芐甲基纖維素紙（DBM紙），重氮苯硫醚
    纖維素紙（DPT紙）和氨基苯硫醚纖維素紙（APT
    紙）
    3二乙氨基乙基纖維素紙（DEAE紙）
    4ECTELA紙
    5尼龍膜
    6聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）
    7其他膜
    （二）各種轉(zhuǎn)移方法
    1毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法
    2真空轉(zhuǎn)移法
    3電轉(zhuǎn)移法
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)十 DNA分子雜交
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）DNA的復(fù)性與雜交反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式
    1雙鏈DNA的復(fù)性過程
    2單鏈探針的雜交過程
    3雙鏈探針的雜交過程
    （二）雜交速率的影響因素
    1探針分子復(fù)雜性的影響
    2探針分子濃度的影響
    3雜交溫度的影響
    4雜交液pH值的影響
    5雜交液中離子強(qiáng)度的影響
    6雜交液中甲酰胺濃度的影響
    7雜交促進(jìn)劑的影響
    （三）雜交反應(yīng)的兩種模式
    （四）雜交分子穩(wěn)定性的影響
    1雜交液中Na＋離子濃度的影響
    2探針分子中GC％的影響
    3雜交液中甲酰胺濃度的影響
    4探針分子長度的影響
    5與目標(biāo)DNA錯(cuò)配的影響
    6雜交液pH值的影響
    （五）雜交的步驟
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)十一 顯色法檢測雜交結(jié)果
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）酶法顯色原理
    1辣根過氧化物酶
    2堿性磷酸酯酶
    （二）免疫法檢測原理
    （三）生物素－親和素法檢測原理
    （四）其他檢測法
    1膠體金標(biāo)記——銀加強(qiáng)檢測法
    2時(shí)間分辨熒光檢測法
    三 試劑與器材
    四 實(shí)驗(yàn)步驟
   實(shí)驗(yàn)十二 PCR法鑒定人的性別
    一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     二 實(shí)驗(yàn)原理
    （一）PCR的引物設(shè)計(jì)
    1引物的長度
    2引物的GC％含量
    3引物的3′端起始堿基
    4引物無回文對稱結(jié)構(gòu)
    5引物自身不能配對
    6兩個(gè)引物的Tm值
    7兩個(gè)引物之間不能配對
    （二）PCR的反應(yīng)體系
    1模板DNA
    2引物
    三 分光光度計(jì)的使用
    四 電泳儀的使用
    五 微量移液器的使用
    六 凝膠攝影
    七 酚的重蒸與飽和處理
    八 RNA酶的使用與預(yù)處理
    九 緩沖液作用原理與Tris·Cl的配制
    十 菌種與DNA樣品的保存
    十一 器皿的清洗處理
    十二 器皿和試劑的滅菌處理
    十三 器皿的硅化處理
    十四 大腸桿菌常用基因型
   參考文獻(xiàn)